發(fā)布時(shí)間:2012-12-10 20:23:05
1．有機(jī)溶劑的選擇：有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力隨蛋白質(zhì)的種類及有機(jī)溶劑的種類而不同。對(duì)曲霉淀粉酶而言，有機(jī)溶劑的沉淀能力，丙酮>異丙醇>乙醇>甲醇。這個(gè)順序還受溫度、高溫消泡劑、PH、鹽離子濃度所影響，不是一成不變的。
2．關(guān)于有機(jī)溶劑的用量：只能根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的沉淀曲線，因有機(jī)溶劑的沉淀能力受很多因素影響，特別是溶存鹽類與高溫消泡劑的影響尤為濕著。
當(dāng)存在少量中性鹽（0.1-0.2mol/L以上）時(shí)能產(chǎn)生鹽溶作用，蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑水溶液和高溫消泡劑中的溶解度升高。多價(jià)陽(yáng)離子與蛋白質(zhì)結(jié)合，就能使蛋白質(zhì)在水或有機(jī)溶劑中的溶解度降低，因而可以降低使酶沉淀的有機(jī)溶劑的濃度。
實(shí)踐得到的參考范圍如下：對(duì)過(guò)濾澄清的枯草桿菌淀粉酶或蛋白酶發(fā)酵液，每容積添加0.2-0.8容積的有機(jī)溶劑所得到的分部沉淀中含大量淀粉酶；添加0.8-1.1容積，分部沉淀物中含大量中性蛋白酶；添加1.1-1.4容積，分部沉淀物中含大量堿性蛋白酶。
3．其它變數(shù)的影響
(1)溫度：有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)的能力受溫度和高溫消泡劑的影響很大。一般言之，溫度越低沉淀越完全。局部區(qū)域有機(jī)溶劑過(guò)濃，能夠嚴(yán)重破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)造成酶的變性失活，在溫度較高的條件下尤為顯著。有機(jī)溶劑，特別是乙醇與水混合時(shí)放出大量熱，使混合液的溫度升高。因此在添加有機(jī)溶劑時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)需要冷卻，一般保持0℃左右，同時(shí)強(qiáng)烈攪拌，以避免有機(jī)溶劑局部過(guò)濃和液體局部過(guò)熱，而高溫消泡劑則無(wú)事。另外，已經(jīng)沉淀的酶對(duì)有機(jī)溶劑變性的抵抗力大，所以，過(guò)分延長(zhǎng)添加溶劑的時(shí)間也是不利的。
(2) pH：蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的溶解度最低，但很多酶的等電點(diǎn)在pH4-5，比其穩(wěn)定的pH范圍低。在這種情況下必須采用目的酶穩(wěn)定的pH，然后是盡可能靠近其等電點(diǎn)。
沉淀時(shí)酶液的溫度、高溫消泡劑和pH不但對(duì)目的酶的收率具有決定性的影響，而且對(duì)酶的組成（各共存酶的比率）及單位重量沉淀物中目的酶的活力都有重要的關(guān)系。例如，固體培養(yǎng)的米曲霉ɑ-淀粉酶，用水抽出并過(guò)濾，清液預(yù)先冷卻，在攪拌下加乙醇至終濃度70%，溫度10℃，pH 5.6-6.0，ɑ-淀粉酶的收率約94%。
有機(jī)溶劑沉淀法有使酶變性失活的傾向，不如鹽析法安全；有機(jī)溶劑還能使發(fā)酵液中的多糖類雜質(zhì)沉淀，沉淀物中有機(jī)雜質(zhì)多；另外分部沉淀的靈敏性方面也不如鹽析法。
為了節(jié)省沉淀酶用的有機(jī)溶劑量，澄清的酶液應(yīng)當(dāng)先在減壓條件下濃縮。但減壓濃縮的倍數(shù)是很有限的，對(duì)枯草桿菌酶發(fā)酵液的澄清液，一般只能濃縮到原體積的40-50%，否則有機(jī)溶劑的沉淀物呈膠糖狀，很難處理。但若在濃縮的酶液中先加入一定量的高嶺土、硅藻土之類，加有機(jī)溶劑與高溫消泡劑后酶的沉淀就分散在這些載體上，沉淀物就比較容易收集。有機(jī)溶劑沉淀物特別適宜于用離心分離法收集。
本文參考《發(fā)酵微生物學(xué)》一書(shū)。
常見(jiàn)問(wèn)題
